流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的单细胞或生物微粒，逐个进行多参数快速定量分析和分选的技术，具有速度快、精度高、准确性好等优点，是非常先进的细胞定量分析技术。 该技术被广泛的应用于细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等多个领域。如细胞周期、细胞凋亡、细胞活力的检测，淋巴细胞亚群与疾病的关系研究，器官移植后的免疫学监测，肿瘤的特异性指标的检测，药物作用机制研究，筛选新药等都离不开流式技术。

随着流式细胞术应用领域的日益广泛，流式抗体及荧光标记产品的种类、数量也在不断增多，加上多色分析实验方案需求的增长，逐渐产生了抗体难选择、荧光难搭配等问题，给实验顺利开展带来了诸多困扰。流式抗体如何选择，也成为了流式技术是否能被成功应用的关键因素之一。

流式抗体如何选择，主要考虑因素如下：

 满足抗体选择的基本条件

流式抗体本身也是抗体，所以首先要满足抗体选择的最基本条件：

① 目标蛋白特异性：确定目的细胞的特异性表面标记或者胞内标记，确定检测指标；

② 种属特异性：严格按照样本种属来源进行选择；

③ 可应用于流式实验：说明书中明确标注可应用于流式实验，并有实验数据图和建议用量；

 确定流式细胞仪的参数配置

在设计流式方案前，根据可能需要同时检测指标的数量，仪器的参数配置和型号选择合适的流式抗体：

① 激光器：常见的流式细胞仪有407nm、488nm 和 633nm三个激光器，但有些机器只配置了一个激光器，因此需要注意的是相同型号的机器激光配置也不一定相同；

② 滤光片：决定流式细胞仪检测通道的数量，同时决定实验设计时你最多可检测指标的数量，荧光素的发射波长跟滤光片有关，发射波长一定要在流式细胞仪的检测范围内；

③ 流式细胞仪具体型号：再次确定检测通道，因为同一个荧光素在不同的流式细胞仪上检测，检测通道不一定相同。

 荧光抗体的选择建议

流式检测的抗体必须要求都有荧光标记，选择时可参考如下建议：

① 荧光标记方式的选择。尽量选择直接标记有荧光的一抗，间接标记二抗会增加实验步骤，清洗多次造成细胞浪费，也会影响实验的准确性；

② 抗原表达量丰度高，选择荧光弱的染料；抗原表达量丰度低或分群不明显，选择荧光强的染料。荧光本身有强弱之分，可根据抗原表达丰度及分群情况选择合适的荧光。如抗原表达丰度低或分群不明显的建议选择强荧光 PE；反之，抗原表达丰度高或分群明显的建议选择最常用的弱荧光 FITC （常用荧光强弱排序为：PE>APC>PE-cy5>Percp-cy5.5>FITC）；

③ 可以尝试选择新型荧光染料，如mFluorTM Violet等。新型染料具有荧光强，稳定性好，对PH 值不敏感和水溶性较好的特点。如 Alexa Fluor488与 FITC 检测通道相同，但是荧光强度和淬灭时间上，前者明显强于后者。

 多色荧光搭配的原则

多色分析方案中荧光抗体的选择和搭配，会受到很多因素的制约：

① 每个检测通道只能选择 1 种荧光素，各通道之间的荧光素可以随意搭配。如FL1 选择了 FITC 标记的抗体，就不能再选择Alexa Fluor488 标记的抗体；而同组实验的其余抗体选择PE或者APC标记，都是可以随意组合的 ；

② 尽量减少所选各种荧光素光谱的重叠，否则将会导致补偿难调。如，PE-cy5 与APC 同时标记，将会导致补偿过度，需换成 PE-cy5.5或Percp-cy5.5。最常用的4色荧光搭配是：FITC、PE、Percp-cy5.5、APC；

 同型对照（Isotype Control），是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，是真正意义上的流式阴性对照。不仅可以用来设定流式细胞仪的电压，而且还可以省去繁琐的竞争封闭步骤。

① 同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型及亚链、相同荧光标记的免疫球蛋白，也要求使用相同剂量，同型对照一定要选择准确；

② 如果是纯化的一抗加荧光标记的二抗，那么应该选择与一抗相对应的同型对照抗体（如样品管为：纯化的CD3+PE标记的二抗+样本；则对照管为：纯化的同型对照+ PE标记的二抗+样本） ；

③ 有些抗体在细胞表面或胞内表达不高，而跟其类似的抗原表达却非常多，那么同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性，就会造成同型对照表达高于抗体阳性表达的现象。这时推荐使用其他阴性对照，如空白对照等；

④ 如果对流式操作不熟悉，或者检测胞内因子、信号蛋白时，建议使用同型对照；如果熟悉流式操作，清楚知道抗体表达情况的客户，可以考虑省去同型对照。